冠狀病毒在水和廢水中的存活

譯文來源：Patricia M. Gundy, Charles P. Gerba，Ian L. Pepper. Survival ofcoronaviruses in water and wastewater[J].Food Environ Virol,2009,1(1):10–14.

翻譯：哈爾濱工業(yè)大學(xué) 王路遙;校對(duì)：哈爾濱工業(yè)大學(xué)陳志強(qiáng)教授，西湖大學(xué) 鞠峰教授(備注：疫情時(shí)期，本文的翻譯是為了使大家更好地了解風(fēng)險(xiǎn)防控知識(shí)，如有不當(dāng)之處，請(qǐng)批評(píng)指正)

摘要：嚴(yán)重急性呼吸綜合征的出現(xiàn)及其潛在的環(huán)境傳播表明，需要更多關(guān)于冠狀病毒在水和廢水中存活的信息。在過濾和未過濾的自來水(4℃和23℃)和廢水(23℃)中測(cè)定了代表性冠狀病毒貓傳染性腹膜炎病毒和人冠狀病毒229E的存活率。在相同的試驗(yàn)條件下，將其與脊髓灰質(zhì)炎病毒1型進(jìn)行了比較。試驗(yàn)水中冠狀病毒的失活高度依賴于溫度、有機(jī)物水平和拮抗細(xì)菌的存在。病毒效價(jià)下降99.9% (T99.9)所需的時(shí)間表明，在自來水中，冠狀病毒在23℃ (10天)水中比在4℃ (>100天)水中滅活得更快。冠狀病毒在廢水中迅速死亡，T99.9值在2～4天之間。除了4℃自來水外，脊髓灰質(zhì)炎病毒在所有測(cè)試水中的存活時(shí)間都比冠狀病毒長。

01

介紹

2003年嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)在全世界造成了8000多例病例產(chǎn)生，死亡率約為10%(Manocha et al. 2003;Centers for Disease Control 2004)。最后已知的爆發(fā)是在2004年北京的一個(gè)研究實(shí)驗(yàn)室。這種疾病的原因被確定為一種新的人類冠狀病毒，很可能起源于麝貓，潛在宿主可能是蝙蝠(Guan et al. 2003; Lau et al. 2005; Wang et al. 2006)。冠狀病毒是有包膜的單鏈RNA病毒，大小從60～220納米不等。它們可以感染鳥類和哺乳動(dòng)物，包括人類，并通過氣溶膠或糞便-口腔途徑傳播。冠狀病毒在爆發(fā)期間的迅速傳播表明，人類冠狀病毒的主要傳播方式是呼吸道飛沫;然而，沒有直接證據(jù)支持這一點(diǎn)(Belshe 1984)。由于迄今為止人類冠狀病毒感染被認(rèn)為是一種溫和的、自我限制的疾病，因此關(guān)于其在環(huán)境中的傳播潛力的信息有限。

鑒于2003年3月在香港高層住宅區(qū)爆發(fā)的涉及300多人的SARS疫情與一個(gè)有缺陷的污水系統(tǒng)有關(guān)(Peiris et al. 2003)，SARS疫情傳播可能與水和廢水有關(guān)。SARS-CoV可在腸道內(nèi)復(fù)制 (Leung et al. 2003)，這一事實(shí)使其成為一種可能的腸道病原體，而SARS病例中腹瀉的發(fā)生率在8%～73%之間(SARS流行病學(xué)工作組，2003)，這引起了人們對(duì)其潛在環(huán)境傳播的關(guān)注。Leung等人(2003)還報(bào)道，從SARS患者小腸中獲得的病毒培養(yǎng)物產(chǎn)量高于作為該病毒靶器官的肺組織。傳染性病毒是從SARS患者感染后3周內(nèi)的糞便中分離出來的(Chan et al. 2004; Liu et al. 2004)。SARS的出現(xiàn)及其傳播問題表明需要更多的信息，特別是冠狀病毒在水和廢水中的存活情況。本研究比較了代表性冠狀病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒1型在自來水和廢水中的存活情況。

02

材料和方法

貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV) (ATCC-990)：一種貓科動(dòng)物的腸道冠狀病毒，在克蘭德爾里瑟貓腎細(xì)胞系(CRFK) (ATCC-94)中繁殖和檢測(cè)。人冠狀病毒229E (HCoV) (ATCC-740)：一種呼吸道病毒，在胎兒肺成纖維細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞系(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓灰質(zhì)炎病毒1 LSc-2ab (PV-1)：一種已知的在環(huán)境中非常穩(wěn)定的人類腸道病毒，在布法羅綠猴腎(BGM)細(xì)胞系中繁殖和檢測(cè)。在單層細(xì)胞中觀察到細(xì)胞致病作用(CPE)后，將感染細(xì)胞在-20℃冷凍和解凍三次以釋放病毒。隨后在1000g離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，加入到9%聚乙二醇(相對(duì)分子質(zhì)量8000)和0.5 M氯化鈉的病毒懸浮液中，并在4℃下攪拌過夜。在10000g離心30分鐘后，用0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; pH 7.4)(Sigma, St. Louis, MO)重懸至原始病毒懸液體積的5%。然后將冠狀病毒進(jìn)行效價(jià)測(cè)定并儲(chǔ)存在-80℃下。脊髓灰質(zhì)炎病毒通過用等體積的Vertrel XF (Dupont, Wilmington，DE)提取進(jìn)一步純化，乳化后以7500g離心15分鐘，隨后收集頂層水層，進(jìn)行效價(jià)測(cè)定并在-80℃儲(chǔ)存。

自來水樣本是從實(shí)驗(yàn)室的冷水龍頭中采集的。水源是地下水，水質(zhì)參數(shù): pH 7.8，溶解固體297mg/L，總有機(jī)碳0.1mg/L。在收集樣品之前，讓水流動(dòng)3分鐘。在未過濾的自來水和通過0.2μm孔徑過濾器去除細(xì)菌的自來水中測(cè)定病毒存活率。將自來水(30mL)加入到無菌的50mL聚丙烯離心管中，以減少附著在容器上的病毒損失。添加無菌硫代硫酸鈉至最終濃度33μg/mL，以使水脫氯。渦旋后，將病毒添加到每個(gè)管中，最終濃度為105 TCID50/mL。再次渦旋離心管并立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管儲(chǔ)存在4℃或室溫下(23℃)。室溫下儲(chǔ)存的離心管用鋁箔覆蓋，以防暴露在光線下。在1、3、6、10、15和21天后對(duì)離心管取樣，并將樣品在-80℃下冷凍，直到它們?cè)诩?xì)胞上被分析。 初級(jí)出水和剩余活性污泥(二級(jí))的樣品來自于美國亞利桑那州圖森市羅杰路污水處理廠，并收集在無菌聚丙烯瓶中。沉淀后收集初級(jí)出水，氯化前收集二級(jí)出水。該設(shè)施一級(jí)出水的典型水質(zhì)參數(shù)為生物需氧量(BOD)和1懸浮固體(10～220mg/L)。通常相比初級(jí)出水，二級(jí)出水中的BOD和懸浮固體減少了90%～95%。將出水(30mL)加入到無菌的50mL聚丙烯離心管中。在添加病毒之前，一級(jí)出水通過0.2μm孔徑的過濾器過濾，并且未經(jīng)過濾的也進(jìn)行測(cè)試。二級(jí)出水僅未經(jīng)過濾的進(jìn)行測(cè)試。然后將病毒添加到每個(gè)離心管中，最終濃度為105 TCID50/mL。將離心管渦旋，立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管覆蓋并保持在室溫(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集樣品，并將樣品在-80℃下冷凍直至分析。 使用噬斑試驗(yàn)或TCID50技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)物上計(jì)數(shù)病毒。在6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中，通過噬斑測(cè)定法(Payment and Trudel 1993)測(cè)定了PV-1的效價(jià)。這是一種直接定量方法，最低檢測(cè)限為10 pfu/mL。將每種稀釋液接種在兩個(gè)孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)中不形成斑塊的冠狀病毒，通過組織培養(yǎng)感染劑量50%技術(shù)(TCID50)在24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中測(cè)定其效價(jià)(Payment and Trudel 1993)。這種技術(shù)確定了顯示出CPE的50%的原液的稀釋度。取稀釋倍數(shù)的反對(duì)數(shù)，得到每毫升TCID50的病毒效價(jià)。該方法的最低檢測(cè)值為每毫升3.7個(gè)病毒。將每種稀釋液接種在至少8個(gè)孔中。在添加病毒之前，任何來自測(cè)試水的樣品都必須在細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)之前過濾，以消除細(xì)菌污染。在pH為7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通過以阻斷可能吸附病毒的位點(diǎn)來制備具有聚醚砜(PES)膜的0.2 μm低蛋白結(jié)合Millex過濾器(Millipore, Billerica, MA)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

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編輯：王媛媛